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Endomicroscopía en Anatomía Patológica. Biopsia óptica

Los avances tecnológicos en el campo de la visión microscópica de las imágenes o la capacidad diagnostica de una gran variedad de técnicas ópticas, obligan a analizar y re-ubicar el papel del anatomopatólogo en la medicina. Ni los microscopios, ni la tinción, ni el procesado de tejidos son hoy en día imprescindibles para diagnosticar una lesión en aquellos campos en los que se esta implantado la biopsia óptica. Se hace necesario contar con publicaciones morfológicas que permitan aprender el estándar-oro de acuerdo con la técnica empleada de estas biopsias in vivo o biopsias ópticas no disruptivas. Este cometido ha de estar en manos del patólogo.El artículo introduce en las técnicas de diagnostico óptico y en las técnicas de visión microscópica no invasiva mostrando los niveles diagnósticos de cada una.

Una biopsia óptica (BO) (1) es una forma no invasiva de diagnóstico con un sistema óptico que realiza un análisis del tejido en superficie o en profundidad usando una de las técnicas siguientes: láser, OCT, infrarrojo, fluorescencia, espectroscopia etc. Es decir, no extrae el tejido del organismo y diagnostica sin una biopsia intrusiva. Al tejido a analizar se accede a través de la superficie del cuerpo, incluido el análisis de la propia piel, o por vía endoscópica.

En Anatomía Patológica el «estándar de oro» es la histología del tejido sano fijado. En las técnicas de BO las imágenes se obtienen en tiempo real y van acompañadas de una considerable información complementaria que permite evaluar la enfermedad in vivo, sin que tengamos todavía un estándar oro. Desde el punto de vista técnico los métodos de biopsia óptica se dividen en dos grandes grupos:

a) Métodos basados en imágenes entre los que se encuentran todas las imágenes de luz coherente del tipo de la: OCT o Tomografía de coherencia óptica, Imágenes de coherencia óptica (OCI), Imágenes de holografía digital (DHI), etc. Las de iluminación estructurada como la endomicroscopía confocal o las mixtas como la microscopia foto-acústica o PAM.

En la figura 1 puede observarse el rango de resolución que alcanzan las técnicas de imagen hoy en día.

b) Métodos no asociados a imágenes: que incluye la espectroscopia de los tejidos (fluorescencia, reflectancia, dispersión fotónica elástica…) con luz coherente o no coherente. Es decir el análisis espectral del tejido de gran ayuda en biología, química o fisiología.

De hecho el término de Biopsia óptica se acuñó para estos últimos, que quedan lejos del área de acción de los anatomopatólogos, a pesar de que una de sus finalidades sea evitar los retardos diagnósticos de malignidad, permitiendo un tratamiento inmediato.

Si utilizamos como definición de biopsia óptica aquella que utiliza energía óptica para obtener información de la estructura y función de los tejidos sin ser disruptiva para los mismos, se encuentra incluida cualquiera de las técnicas no invasivas de obtención de imágenes de alta resolución mediante cortes ópticos.

Esta definición está cerca de la competencia de un anatomopatólogo por su formación ya que el diagnóstico se basa o bien en las modificaciones de la histología normal o en la morfología de las células y el tejido.

La constante evolución del microscopio ha conseguido romper el límite de la resolución óptica con numerosas técnicas microscópicas sin especificidad física o química basadas en iluminación estructurada, interferometría u holografía. Mientras que las técnicas espectroscópicas como de fluorescencia, infrarroja-IR o Raman, detectan las características físicas y químicas de los espécimenes por lo que algunos las llaman patología espectral.Para llegar a las técnicas ópticas no lineales con luz coherente de elevada energía en la que la señal reflejada no está relacionada con la que entra (dobla la frecuencia incidente) y nos da información sobre la estructura o interacción intermolecular.

Por eso estos sistemas reciben el nombre de microscopios químicos y permiten detectar cambios moleculares en superficie (SH o segundo armónico y la SG o generación de sumas de frecuencias) o en la orientación y distribución molecular (THG o generación del tercer harmónico, el CARS o dispersión coherente Raman anti-Stokes y el TPEF o la fluorescencia de dos fotones y TTEF o de tres fotones).Todas ellas se han miniaturizado utilizando nuevos materiales y MEM¹s, y se han introducido en los sistemas de endoscopia convirtiéndolos en micro-endoscopios morfológicos o químicos.

Al permitir el análisis de los tejidos in vivo, tienen una enorme proyección en Genómica, Proteómica y Metabolómica e influyen directamente en cirugía, telemedicina, diagnóstico de cáncer, terapias personalizadas y enfermedades cardiovasculares

SUPER-RESOLUCIÓN

En este articulo vamos a estudiar las técnicas ligadas a la Biopsia Óptica en su sentido amplio (espectrales y de imágenes) haciendo especial mención a las basadas en imágenes en su mayoría en el campo de la super-resolución.

Por lo general las imágenes de BO son imágenes con una resolución óptica superior a la teoría de Abbe cuyo limite viene impuesto por l/2NA e igualmente superior a la ley de Rayleigh 0.61*l/NA que considera que dos puntos pueden resolverse si el centro de la función de dispersión-PSF (point spread function) de uno cae dentro del primer cero (first zero) de la PSF centrada en el segundo punto, siempre que ambos puntos tengan un contraste superior al 26% ya que la resolución lateral depende de la luminosidad y del contraste del objeto

Un sistema alcanza el nivel de super-resolución cuando ve objetos que están por encima de este límite y por lo tanto:La fórmula de la super-resolución N es tal que l/2NNA sea el límite posible de resolución, siendo N*resolución l/2NA.

La resolución óptica del sistema se ve limitado por la técnica de muestreo y captura de la imagen. En las cámaras CCD, la ley de Rayleigh debe adaptarse a la teoría del muestreo de Nyquist, de forma que para poder distinguir un objeto, este debe estar separado entre 2,3 a 3 veces el aumento del microscopio (M) por la resolución óptica del sistema óptico (Dd ) dividido por el tamaño del píxel de la cámara (Dx)

Dd * M / Dx = 2,3 – 3

O lo que es lo mismo el límite de resolución espacial debe muestrearse como mínimo con dos píxeles. A este efecto se añade el tamaño del píxel (el más pequeño en chips de 2/3» es 2,7 µ (3) y que las cámaras mono-chip para obtener el color realizan una integración de los píxeles sensibles al color (RGB) con lo que la densidad de muestreo se reduce